Zvětšit obrázek

Klony brzo měla začít sužovat kumulace vývojových a zdravotních poruch. Japonská myška s klonovanými „potomky“ ale existenci nějakého klonovacího limitu nesignalizuje. Všechny tmavé myšky mají stejný genotyp, jsou replikami jednoho a téhož jedince - něco jako jednovaječná dvojčata posouvaná v čase po dobu 25 generací. Bílá myš je macecha - náhradní matka, která geneticky nemá s potomstvem nic společného. Jejím úkolem bylo jen myší embrya donosit a kojit. (Kredit: Riken CDB, Cobe)

Krátce po zveřejnění zprávy o úspěšném naklonování savce se vyrojili odpůrci s kritikou  neetičnosti takového počínání. Proti nepřirozenému rozmnožování, při němž jsou tatínci zbyteční stejně jako jsou zbytečné i jejich spermie, se argumentuje i tím, že s takto vyrobeným „potomstvem“ to musí jít z kopce až do nevyhnutně smutného konce. To kvůli akumulaci genetických chyb. Teorie vzniku mrzáků je logická. Už proto, že klonování vlastně není nic jiného než snaha dělat ze starého nové. A jak víme, u kmetů už ne všechno slouží jako dříve i proto, že v DNA mají hodně chyb. Bylo by tedy naivní si myslet, že když ošoupané chromozomy prolezlé mutacemi vložíme do mladičké buňky, dostaneme zdravého statného junáka nebo junačku. Někde asi bude hranice, za kterou neradno chodit. Kde ale je ta linie, na níž se „jetá“ DNA novému životu začne mstít?

Zvětšit obrázek

Graf úspěšnosti klonování. Po počátečních problémech, kdy se výsledky pohybovaly okolo 4 % se situace zlepšila a i u 25. generace se drží nad hladinou 20 %.

Dělat děti z chromozomů těch, kteří si již na tomto světě své užili, je trestné nejspíš všude na světě. Přesto je lákavé znát odpověď na otázku, co by, kdyby. Nejde tu ani tak o neplodné miliardáře, kteří když budou chtít, se ke svému klonu v kočárku stejně dostanou. Jsou ale i ušlechtilejší cíle, jako například záchrana mizejících druhů. Teruhiko Wakayamu napadlo prověřit opakovatelnost klonování na myškách. Zahájil proto pokus s přenášením jader ze „starých“ buněk do mladých vajíček.  Aby v uměle sestaveném zárodku nebylo chromozomů moc a nehádaly se, z vajíček jejich  jádro odstranil. Tělní buňka má chromozomů akorát, a když se všechny (s celým jádrem) přenesou do vykuchaného vajíčka, rázem tu je embryo. Pak už jen stačí, aby ho donosila náhradní matka, a kopie původního dárce je na světě. A přesně tak to Wakayama dělal. Zpočátku sám. Nyní na tuto rutinu má tým spolupracovníků. Když klonované myšky dospějí, vše s nimi opakují a množí je tak stále  dokola.

V Centru pro vývojovou biologii v Cobe již takové tvoření mladého ze starého běží od roku 2005.  Na otázku, kde je hranice klonování, dává překvapivou odpověď. Po osmi letech rozmnožování klonů z klonů vedoucí týmu z laboratoře pro Genomické přeprogramování svým vyjádřením šokoval, konstatoval totiž: „Předpokládaná klonovací hranice vlastně neexistuje.“

Kdo je Teruhiko Wakayama? Lze mu věřit?

Zvětšit obrázek

Klonování zvládl Teruhiko Wakayama jako jeden z prvních na světě. Fotka je z roku 1998, kdy pracoval na University of Hawaii v Honolulu. Získal přezdívku „zlaté klonovací ručičky“.

Rozhodně to není mluvka. Je za ním hodně vysoký štos publikací s velkou citovaností a má to nejlepší renomé. V klonovacím světě profíků se jeho rukám přezdívá „zlaté klonovací ručičky“. Media si ho jeden čas také všimla, to když oživil zmrzlého myšáka, který zůstal šestnáct let zapomenut a jako kost zmrzlý v mrazícím boxu. Nešlo o oplodňování jeho zmrazenými spermiemi. Wakayama použil metodu jemu bližší – jádra  rozmrazených mozkových buněk přenesl do čerstvých myších vajíček a z takto sestavené buňky vyrobil „potomka“, který byl geneticky zmrzlý myšák. Produkoval „jeho“ spermie a v lidské terminologii bychom řekli, že plodil pohrobky šestnáct let po své smrti.

Zvětšit obrázek

Wakame, první z klonovaných myší vzniklých přenosem jádra somatické buňky má ve svém jménu něco po svém stvořiteli. Dnes se už jména nedávají, byly by jich tisíce. (Kredit: Riken CDB, Cobe)

Nové zprávy
Naše a evropská media se Japonsku věnují poměrně hodně, většinou se to ale týká vývoje Nikkei indexu, obchodování na japonské burze, pokroku v robotice, případně co nového ve Fukušimě. Jakoby biologický výzkum ani neměli. A přitom nejen u Země vycházejícího slunce, ale i v případě dalších zemí východní Asie to začíná dělat dojem, že nám asijský vlak s elektronikou, auty, stavbou lodí atd. začíná ujíždět i v oblasti biologického výzkumu. Zatímco dříve jsme jako autoři Osla byli zvyklí při vykrádání zajímavých článků z prestižních časopisů na to, že v soupisce podílejících se autorů figurují zástupci západních laboratoří, nyní tomu stále častěji tak není. Ani tentokrát ne. Pod výsledky z Cobe jsou mezi spolupracovníky jen Číňané a Vietnamci. Možná i proto se o tom moc nepíše anebo se o tom píše jen jako o zajímavosti, kterou Wakayama začal ještě co by doktorand na fakultě environmentalistiky na universitě v Yamanashi a že dnes už má 25 generací klonů. Ne že by to byla nepravda, jen to není celá pravda a nic moc z takové formulace nevyplývá. Možná nebude na škodu se podívat podrobněji, co  Asiaté ve svých klonovacích kuchyních uvařili. Časopis Cell Stem Cell píše, že na samém počátku vzal Wakayama do pokusu ne jednu, ale více myšek. Nakonec pracoval se třemi (klonoval tři genotypy). Z nich se dvě jako dárkyně buněčných jader moc neosvědčily a jejich „rod“ zanikl. Pokus pak pokračoval už jen s jedním genotypem a jen o tom se media zmiňují. Zapomíná se tedy na to, že nejde o náhodně vybranou myšku. V pokusu se hned na samém počátku selektovalo na co nejlepší klonovací výsledky. Zřejmě měl Japonec šťastnou ruku a vybral si geneticky velice zdravého jedince. Ty dva neúspěšné (ze tří) by se zmiňovat pro pořádek ale měly. Třeba jen proto, aby to ochladilo horké hlavy, které by mohlo napadnout hned začít klonovat kde co, i člověka. On ten rozdíl mezi prakticky inbredními liniemi dlouhodobě selektovaných laboratorních myší a naším genomem je, co se týče chyb, dost velký na to, aby takový pokus moc slavně nedopadl.

Zvětšit obrázek

Živý myšák připravený z tkáně „tatínka“, kterého zapomněli v mrazícím boxu. Hnědá myška je jeho klonem, který má 100 % jaderných genů svého dávno mrtvého dárce zmrzlé tkáně.

V případě Wakayamy ale zvolený přístup selekce na myš, která je ke klonování nejvhodnější, na škodu nikterak nebyl. Hlavním cílem totiž bylo získat odpověď na otázku, zda existuje nějaká hranice klonování u „zdravých“ jedinců. Tedy zda samotný proces klonování sám o sobě představuje riziko nárůstu nebezpečných genetických chyb, případně jak rychle se projeví. 

Takt vypadalo torzo myšáka, kterého Atsuo Ogura vyndal po 16 letech z mrazáku nastaveného na -20 stupňů Celsia. Přivedení jeho genů k životu v novém těle se stalo nadějí pro ty, kteří uvažují o z mrtvých vstání mamuta,...

Klasika
Když se lidské lidské vajíčko (oocyt) rozhodne, že už je zralé, vydá se na cesty. Jeho prvním krokem do života je skok. Když se mu podaří trefit se do nálevky vejcovodu, má jednu z rizikových etap své pouti za sebou. Krátkou dobu si to užívá a za pomoci třásní a řasinek se jen tak nechává unášet proudem, vstříc dalším dobrodružstvím. Vajíčko se nevydává na cesty samo. Jako bohatá nevěsta má početný doprovod. Drůžičky jí dělají kumulární buňky. V učebnicích se o nich píše, že vajíčko vyživují a chrání. Je to ale kapánek jinak. Nejde tu jen o jakési kojné, ani o veselou družinu obskakujíc oslavenkyni, aby se cítila jako v bavlnce. Kumulární buňky je nejspíš sehraná parta dohazovaček, které tvrdě dřou na tom, aby jim nevěsta nezůstala na ocet. Nemají to lehké, protože spermie jsou mužským produktem a podle toho se i chovají. Dokud o nic nejde, lenoší. Probírají se, až když se okolo nich začne promenádovat nějaká sukně. Kumulární buňky ale sukně nemají, a tak spermiím mávají pod nosem steroidním hormonem. To stačí, aby z letargických peciválů se rázem stali hyperaktivní všude možně šmejdící natěšenci.

Jenže jak čas běží, nevěsta rychle stárne a správný okamžik se promarnit nesmí. Jak to kumulární buňky dělají? Jsou to profesionálky a s nějakými chvalozpěvy typu Kecala z Prodané nevěsty se nezdržují. Ví, co zabírá, a tak spermie pohladí na ocásku. Tam, kde mají forrichtung, kterému se odborně říká CatSper. Jde o iontové kanály, které na jemný dotek progesteronem reagují roztažením. Membrána se tak na okamžik stane prostupnou pro ionty vápníku. Těch je okolo habaděj, protože ve vejcovodu je zásadité prostředí. Vtrhnutí dvojmocných iontů do spermie má stejný efekt, jako když kapitán zařve do strojovny “plný chod” - spustí se metabolické kaskády a bičíky se roztočí na maximum. Ty pak tlačí hlavičku mocnou silou do víru milostných hrátek, vstříc novému životu.

Wakayama již jako pracovník laboratoře pro Genomické přeprogramování. Jeho pokusy dávají odpověď na celou řadu otázek týkajících se rizika používání „secondhandové“ DNA. (Kredit: Riken CDB, Cobe)

Klonovací excese
Také ve Wakayamově pokusničení hrály kumulární buňky hlavní roli. Jakmile jeho myšky dospěly, tak z nich, ve věku tří měsíců, začali dělat klony. Práce začala výplachem vejcovodů, při němž získaly vajíčka. O ty jim ale tentokrát ani moc nešlo. Hlavní snahou bylo získat buňky, které vajíčko doprovázejí (kumulární). Proč nepoužili k množení vajíčko? Oni ho použili, ale ne tak, jak bychom si představovali. Dokonce používali i vejce jiných myšek. Proč je vajíčka nezajímaly? Obnáší totiž jen jednu polovinu dědičné informace, druhou musí dodat opačné pohlaví, aby vznikl život. Tatínka ale v tomto případě využívat nehodlali, a tak z vajíček použili jen jejich obaly s pomocným aparátem, který je v cytoplazmě. Jádro z vajíčka s neúplnou DNA výbavou odsáli a zahodili. Chybějící informaci nahradili vpravením celého jádra. A právě k tomu jim kumulární buňky byly dobré. Protože tělní (somatické) buňky mají kompletní dědičnou informaci (své myší nositelky), tak jim ze skládačky neúplného vajíčka s jádrem z kumulární buňky vznikala embrya. Všechny zárodky byly jednoho pohlaví a byly klonem své „předlohy“.

Zvětšit obrázek

Schema somatického klonování. Při něm přichází k dobru již jednou „jetá“ DNA od těch, kteří si na tom světě už něco užili.

Dál už vše probíhalo přirozeně – vajíčka s kompletní genetickou informací se začala po mírném šťouchnutí v kultivačním mediu dělit a ta správně nastartovaná embrya pak přenesli do těch nejlepších inkubátorů - děloh adoptivních matek. Tak už to v Japonsku dělají téměř celé desetiletí a výsledkem je oněch pětadvacet generací klonovaných „potomků“. Tímto jakýmsi „neposkvrněným početím“ připravili od jedné myšky půl tisícovky geneticky stejných mláďat, která jsou jakoby jednovaječnými dvojčaty,  jen poněkud posunutá v čase. Všechna mají stejnou jadernou DNA, takovou, jakou má zakladatelka linie klonů. Nic zatím nenasvědčuje tomu, že by něco mělo bránit v dalším úspěšném pokračování tohoto kontroverzního způsobu rozmnožování.
 

Jedním z japonských poznatků také je, že efektivita tohoto množení není stále stejná. Počáteční  klonovací zahřívací kola moc optimismu nenabízela (úspěšnost se pohybovala v rozmezí 4-5 %). Později se ale vyčasilo na více než 20 % a tato hodnota již zůstává prakticky stabilní a udržuje se i v zatím poslední, 26. generaci. O nějakém poklesu a konci tedy zatím nemůže být řeč. Proto se Wakayama odhodlal k prohlášení o neexistenci limitu klonování. Proč byly na začátku výsledky jeho pokusů tak tristní a vyhlídky udržitelnosti klonů tak mizivé, je otázkou. Možná v tom sehrálo svou roli postupné vylepšování technologie klonování. Lichou se v tomto případě ukázala být snaha „totálního“ párování. Soudilo se, že výsledky klonování může vylepšit to, když dárkyně DNA  (jádra kumulární buňky) bude stejná s dárkyní vajíčka. Pokus ukázal, že tato představa je lichá. Kompatibilita toho, co tu hraje jen roli jakéhosi buněčného inkubátoru (vejce s cytoplazmou), s tím, co tu hraje vedoucí úlohu (jaderná DNA), je nepodstatná. Pro tvorbu klonů jsou heterogenní dárci stejně vhodní jako ti příbuzní. A to není špatné zjištění pro ty, kteří mají v úmyslu klonovat mamuty.

Zvětšit obrázek

Technická stránka tvorby klonu: Jádro ze somatické (kumulární) buňky je nasáto do skleněné jehly a jako injekcí vpraveno do vajíčka. Tomu bylo jeho vlastní jádro již podobným zákrokem předtím jinou skleněnou jehlou odsáto. Aby vajíčko „neutíkalo“ přidržuje ho podtlak ve větší skleněné pipetě (vlevo). (Kredit: Riken CDB, Cobe)

Hmotnost
Za důležité kritérium zdravotního stavu se považuje hmotnost jedinců v populaci. Ta v případě japonského pokusu zůstala po celou dobu (25 generací) stále na stejné úrovni. Na první pohled velmi potěšitelné zjištění. Jenže toto konstatování je také jen část pravdy. Radost v tomto případě poněkud kazí fakt, že ačkoliv hmotnost zůstala zachována, placenty měly klonované myšky dva- až třikrát větší. Proč se u nich vyvíjí placentomegalie, není jasné. Jak ale připařovací pokusy na konci pětiletého pokusu ukázaly, nijak zvlášť velké dělohy a o to menší těla myškám nevadí. Dobré na faktu placentomegalii je, že bytnění děloh se s postupujícím počtem generací nezhoršuje, příčiny, které abnormalitu způsobují, nemají tedy kumulativní účinek a zvířatům viditelné komplikace nepřinášejí.

Telomery
V počátcích klonování celá řada autorů upozorňovala na riziko postupného zkracování délky telomer. Očekávalo se ošoupávání konců chromozomů, po němž mělo následovat spouštění apoptózy – buněčného programu řízené sebevraždy. V tomto pokusu se ale žádné krácení telomer ani sebevraždy nekonaly a soudě podle toho, že u zvířat se ani u té poslední 26. generace nic mimořádného neděje, nemuselo by z tohoto mráčku obav pršet ani v budoucnu. Schopnost  enzymů z opravářských čet hlídajících v jádře funkčnost DNA je tedy přímo fantastická – mnohem větší, než se soudilo.

Plodnost
Plodnost je další z důležitých měřítek zdravotního stavu. Japonci zhruba v polovině pokusu náhodně vybrali čtyři klonované myšky (z dvacáté generace klonů) a dopřáli jim návštěvu  neklonovaných samců. Ve všech čtyřech případech si padly páry do oka a z jejich spojení se narodila zdravá mláďata. Ve vrzích byl i obvyklý počet novorozených myšek. Klony klonů po všech těch frajkumštech, co s jejich genomem vědci páchali, zůstávají plodnými a dobrými matkami.

Genová exprese
Dalším strašákem skeptiků byla možnost postupných změn vzoru genové exprese. Rozdíly ve vyjádření  některých genů v orgánech, jako jsou játra a mozek, u klonů zaznamenány byly, nicméně tyto rozdíly mezi kontrolou a klony nijak zvlášť nevybočily. A hlavně, jednou navozený posun (vzor) se v průběhu dalšího pokračujícího klonování už téměř neměnil. 

Klonovací lektvary
Jednou z široce používaných látek v klonování je činidlo zvané trichostatin. Je to antibiotikum, o němž se ví, že selektivně tlumí některé z histonových deacetyláz. Zamotaně vědecky řečeno, jde o enzymy navážející se do genové exprese. Jakoby překážejí faktorům, co  mají v buňce v popisu práce přepis pokynů zapsaných v DNA, čímž znesnadňují jejich připojování k chromatinovým vlákénkům. Chemicky jde u trichostatinu o inhibitor deacetyláz. Neméně matoucí přiblížení jeho činnosti skýtá formulace o epigenetických aktivitách. V lidštině si pod tím můžeme představit záležitosti, kterými vnější prostředí reguluje činnost našich genů. Asi tak, jako když se denně budeme opíjet, geny se nám přenastaví tak, aby se s krizovou intoxikací organismus snáz vyrovnával. Že to není zadarmo, sem už nepatří. Klonovací mágové tvrdí, že tato látka je základem jejich úspěchu. Mají pochopitelně na mysli trichostatin, ne alkohol. Využívají ho k nucenému dozrávání buněk. A když to zjednodušíme na maximum, tak u somatického klonování jde o dvě věci. Nejprve je potřeba buňku, která se již nasměrovala na svou životní dráhu, a je tedy ve vyvinutějším stadiu, za pomocí zaříkadel v podobě chemických lektvarů nutné vrátit „v čase“ zpět. Chceme od ní, aby se rozpomněla na to, jak dříve bylo všechno lepší, a aby také uměla věci jak zamlada.  Po takové proměně je ale pak také potřeba její fantazírování utnout a vrátit ji zpět do reality. Nové reality v jiném těle a s jinými povinnostmi A o tom somatické klonování je.

Zvětšit obrázek

Šestadvacátá generace myší samičky. K plození klonovaných mláďat tatínka netřeba. Nic nenasvědčuje tomu, že by myšky, v nichž koluje již „šestadvacetkrát jetá“ DNA, nějak strádaly. (Kredit: Laboratory for Genomic Reprogramming, Cobe)

Pokus o rekapitulaci
V pokusech Wakayamova týmu se vyndavalo jádro z dospělé buňky (buňky s nalinkovanou budoucností). V takto dospěláckých buňkách jsou přístupné jen některé geny. Hodně „šuplíků“ už mají  zamknutých. Nejinak tomu je u kumulárních buněk. Jsou totiž již také vysoce specializované a od mnohých skříněk klíče zahodily. Jejich omlazením pomocí chemie jim dvířka ke genům vědci zase otevřeli. To ale nebylo všechno. Se zpřístupněným vercajkem bylo potřeba je zase naučit zacházet. A právě při tom si vypomohli výše zmíněným trichostatinem. Nyní panuje názor, že jde o látku, která omlazeným buňkám pomáhá dozrát (byť to je na nižším stupni vývoje). Napomáhá jim složit novou zkoušku dospělosti. I když v tomto procesu je toho hodně, co nevíme jak funguje, a ať už je role trichostatinu jakákoliv, rozhodující je, že to s ním jde většinou lépe. A kdo to s ním umí, tak mu úspěšnost jeho práce zhruba zdvojnásobuje. Dlouhodobý pokus s přeprogramováváním genomu ukázal, že to trichostatinu šlo stejně dobře jak na samém začátku pokusu, tak při pětadvacátém klonovacím kolečku.

Je těžké si vybrat, který z asijských poznatků je tím nejzajímavějším. Pro někoho to může být rozptýlení obav z postupné degenerace klonů. Pro jiné to může být vyvrácení obav z možného zkracování telomer. Mnohým se nebude líbit, že už nepůjde jen tak malovat čerta na zeď v podobě kumulativního nárůstu degeneračních změn. Z poctivého, desítky let trvajícího pokusu, jsou všechny poznatky důležité a v mnohém změnily naše představy o klonování. Nemusí se nám to líbit, ale klonování se zase posunulo o notný kus blíže praxi. Spolu s tím i uplatňování geneticky manipulovaných organismů. Jejich příprava je totiž často hodně složitá a klonování je elegantní a levná cesta, jak lze pracně získaný vzácný materiál v krátké době namnožit. S uplatňováním nových poznatků při záchraně ohrožených druhů asi mít problém nebudeme. Klonování navíc dovoluje získat zdravé a plodné potomstvo, a to bez ohledu na to, zda původní dárce buňky ještě žije, nebo už je dávno na pravdě Boží. Nad dalším uplatňováním somatických klonů budou zástupci bioetických komisí jistě hodně a dlouho disputovat a i legislativci si při tom přijdou na své.

Prameny:
www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1934590913000088Journal reference: Cell Stem Cell
The Japan Times
The Center for Developmental Biology, RIKEN