Zvětšit obrázek

Juergen A. Richt, vedoucí kolektivu, který publikoval informaci o skotu bez prionů v časopise Nature.

Skot odolný BSE byl již avizován v polovině roku 2004. Pak ale celá záležitost náhle utichla. Tehdy se jednalo o telata skotu v Koreji a v Japonsku. Tento výzkum podporoval japonský pivovar Kirin. Ten ale z obav před tím, že si příznivci zlatavého moku dají do souvislosti jeho výrobu s genetickými modifikacemi, se stáhnul dopozadí a celý projekt usnul. K velkému překvapení všech je za tímto novým odolným skotem bez prionů zase Kirin. Jen kolbiště se změnilo. Pokusy probíhají na Americkém kontinentu. To zřejmě japonské pijany už tak nedráždí. Fotografie nově připravených zvířat, které uveřejnil prestižní časopis Nature, ale nemají téměř žádnou vypovídací schopnost. Zvířatům jsou na fotkách sice vidět roztomilé hlavy, ale posoudit, zda zvířata nemají nějaké vývojové vady, z nich nejde. Rozhodli jsme se požádat účastníky projektu a představitele firmy Hematech o poskytnutí pořádných fotografií. Marně. Začal v nás hlodat červík podezření, že neochota má nějaký důvod. Komunikací s autory studie se nám postupně podařilo získat další podrobnosti. Než spoléhat na cizí názor, je lepší udělat si na věc vlastní názor. K tomu je ale třeba mít informace. Tady jsou.

Úvod
Možno přeskočit, jde jen o pár slov pro ty, jež nejsou v oblasti transmisivních chorob zcela doma.  Priony jsou proteiny, které se v buňkách tvoří přirozeným způsobem. Změněná forma tohoto proteinu způsobuje smrtelné nemoci označované jako transmisivní spongiformní encefalopatie (TSE). Nejznámější z nich je  BSE.

ARS, Hematech, Kirin a Trans Ova Genetics

Zvětšit obrázek

Japonský pivovar Kirin Brewery Co, je dlouholetým sponzorem biotechnologií.

O projektu většinou hodně vypovídá to, jaké instituce za ním stojí a kdo jej financuje. Zpráva o „BSE free“ skotu vzešla z Výzkumného pracoviště ARS (Agriculture"s Agricultural Research Service ). Jde o zařízení spadající pod americké ministerstvo zemědělství.  To nám ale moc neřekne, protože ARS je kolos s pobočkami ve stovce lokalit. Výzkum zaměřený na  „skot bez prionů“ se uskutečňuje v Národním centru pro choroby zvířat (NADC) ve městě Ames, stát Iowa.  Na tomto místě toho ale moc neudělali, vlastně se tu dělá jen „špinavá práce“. Sledovali tu zdravotní stav osmi holštýnských býčků. Hlavní kus tvůrčí práce, vytvoření gmo zvířat, zajistila ve svých laboratořích  soukromá firma Hematech Inc. s výzkumným střediskem v Severní Dakotě (USA). Hematech není v oboru transgenního skotu nováčkem, na svém kontě má krávy, které jako takzvané živé biorektory. Měly by produkovat ve velkém polyklonální protilátky, zatím ale moc neprodukují a tyto práce  jsou jen v různém stádiu ověřování. Předpokládá se, že krávy budou sloužit k tvorbě látek, které se uplatní v léčbě virových bakteriální a autoimunitních onemocnění. S těmito krávami se v literatuře setkáte pod firemní značkou TC cows (TC krávy). Že by se jejich produkty již dostaly k nějaké větší praktické aplikaci, to se nám zjistit nepodařilo a tak to jen přiživilo naší podezíravost, že v případě skotu bez prionů, půjde o něco podobného. Společnost Hematech má ale i přes nepřízeň praktických aplikací stále nevysychající zdroj finančních prostředků. Rozbíhá stále nové a nové aktivity. Jak je to možné?  Hematech vzniknul jako malá americká firmička. Většího rozmachu se dočkala v době, kdy se jí rozhodl podporovat japonský pivovar KIRIN. Další strategicky významný tah udělala v roce 2003,. Tehdy se propojila s Trans Ova Genetics. To je jeden ze světových lídrů v oblasti získávání a přenášení embryí skotu. Tímto „sňatkem“ získal Hematech parťáka se zkušenostmi s tím jak pracovat embryi. Logicky následovala tvorba embryí, která ve svých buňkách mají něco navíc a  tvoří zmíněné bioreaktory (TC krávy), nebo jim něco chybí, jako v případě skotu bez prionů.

Jak se dělá zvíře bez prionů?
Jednoduše. Vezme se fibroblast a provede se u něj knokaut příslušného genu. Pak už se jen jiné buňce (vaječné buňce) její vlastní genetická informace kapilárou vycucne a podstrčí se jí jádro ze zmíněného fibroblastu.  Když se to udělá šikovně, embryo si toho nevšimne a narodí se jedinec, který je normální. Tedy až na to, že nemá prionový protein.

Trošku podrobněji
Jeden knokaut ale ve skutečnosti nestačí. Na kultuře buněk fibroblastů je potřeba provést knokauty dva. To proto, protože gen má dvě části (jednu alelu získáváme od matky, druhouod otce). Aby buňka prionový protein vůbec netvořila, je potřeba zničit obě součásti genu. Na dva knokauty jsou tedy  potřeba také dva nástroje. Říká se jim vektory. Vektory jsou sestaveny tak, aby selektivně našly a narušily jen to místo v genomu,  kde je gen pro prionový protein.
Nejprve byl proveden zásah jedním vektorem. Jenže ono se to hezky řekne, ale jak tak velkou molekulu dostat do buňky? K tomu se používá elektrický šok (elektroporace).  550 voltů buňce neuškodí, jen se v její membráně na chvíli objeví otvory. Ty učiní membránu propustnou i pro větší molekuly. V tomto případě naše vektory. Teď už jen zbývá doplnit, že se tyto linie fetálních buněk bez prionového proteinu podařilo ustavit u buněk starých 40 – 60 dnů po početí. Tři z těchto fetálních buněčných linií bez prionů byly reklonovány a daly vznik  telatům.

GMO a ještě k tomu klony
Býčci bez prionů jsou vlastně geneticky modifikovanými organismy. GMO jsou proto, protože jejich genom byl upraven.  Na jejich vzniku se ale podílela ještě jedna technika - klonování. Jádrem z fibroblastu se nahradilo jádro vaječné buňky. Zvířata jsou tedy současně klonem zvířete, ze kterého jsou odebrány fibroblastové buňky.

Zvětšit obrázek

Výzkumné a vývojové středisko firmy Hematech ve státě Iowa (USA).

Důvěřuj, ale prověřuj
Jednou věcí je vše potřebné provést. Druhou zase je se přesvědčit, jestli se to všechno povedlo.
Aby si vědci ověřili, že narozená telata jsou skutečně bez prionového proteinu, v hantýrce genetiků že obě alely genu pro prionový protein jsou poničené, neboli že jsou mínusové, což je jen jinak vyjádřeno že jsou genotypu:  - / - (se všemi výrazy se lze v odborné literatuře setkat), odebrali zvířatům kousky tkáně z ucha. Z buněk ucha vypěstovali linie fibroblastů a ty pak genotypovali.  To znamená, že přečetli buňkám jejich genetický kód. Pochopitelně nečetli v buňkách genetický kód celý, ale jen v místě, kde je zapsán gen pro tvorbu prionového proteinu. Čtení vlastně nebylo čtením v tom smyslu, jak jsme zvyklí, že by se stanovovalo pořadí nukleotidů. Stačilo jen označit začátek a konec genu pro tento protein značkami nazývanými primery a přidat stavební kameny ze kterých je DNA tvořena a enzym polymerázu. Tento enzym dokáže množit úsek DNA vymezený zmíněnými značkami. Prakticky dochází k něčemu podobnému, k čemu dochází při dělení buňky, kdy si buňka musí zmnožit svůj genetický materiál. Každá nově vznikající buňka musí dostat svojí kompletní porci genů. Zatímco u buněk z ucha od normálních zvířat se tento gen daří namnožit, u buněk z BSE free zvířat se to nezdařilo. Tím si vědci ověřili, že se jim pokus podařil a že skutečně získali zvířata, která ve svých buňkách gen pro prionový protein nemají. Teda vlastně mají ale není stejný jako u normálního skotu. Je poničen.

To ale navozuje další problém. Je-li gen porušený,  nemuselo by to ještě znamenat to, že se vůbec žádný protein netvoří. Proto musely následovat další testy - funkční testy. Odebrali zvířatům nervové buňky z mozkového kmenu a pomocí protilátek zjišťovali, zda se jim prionivý protein podaří prokázat. Zatím co u normálního skotu se proužek s prionovým proteinem v testech objevil, u těchto zvířat ne. S tímto výsledkem se už vědci spokojili. Byli si jistí, že skot bez prionového proteinu skutečně mají. A že se jim dvojitý knokaut (proti oběma alelám prionového genu) v době, kdy nynější telata rostla ještě jen jako linie fibroblastů v kultuře, podařil.

Claudio A. Soto, profesor na University of Texas již několikrát avizoval, že do půl roku bude mít test na priony z krve (naposled v roce 2005). Nikdy z tohonic nebylo. Konečně se naněj štěstí usmálo, stal se členem týmu, který se podílel na vzniku „BSE free“skotu.

K čemu je prion a prionový protein jsou dobré
Prion není dobrý k ničemu. Je to infekční částice, která vzniká zašmodrcháním prionového proteinu. Prionový protein je ale substance, která je v mnoha typech buněk těla. Nejvíce ho je v mozkových buňkách. K čemu slouží, nevíme.

Zakopaný pes
Právě proto, že stále není jasné, k čemu vlastně prionový protein v těle máme, bylo třeba pečlivě posoudit, jestli zvířata bez tohoto proteinu mohou žít. Bylo třeba zjistit zda zvířata, která jej nebudou mít, nebudou tpět a zda budou schopna odolávat infekcím a zda budou po všech stránkách zdravá? Pokud by totiž tomu tak nebylo, znamenalo by to, že snaha založit chovy, keré by člověka neohrožovaly nákazou BSE, a využívaly k tomu zvířata bez prionového proteinu v těle, by byla cestou slepou.
A tak se stalo, že ze „špinavé“ práce se rázem stala jedna z nejdůležitějších činností - zkoumání zdravotního stavu klonovaných zvířat. Do sledování vzali všech 12 telat. Pod dozorem byla od narození až do doby, kdy jim bylo 20 měsíců.

Hmotnost
Že je se zvířetem něco v nepořádku se většinou projeví na přírůstcích živé hmotnosti. Průměrná hmotnost telat v době jejich narození byla 46kg.  Denní přírůstek 0,91 kg/den (od narození do 10 měsíců). Oba tyto parametry jsou v pro holštýnské plemeno skotu vpořádku.

Další šetření
Také rozbor krve neukázal na žádné abnormality. Vyšetřování zdravotního stavu zahrnovalo také měření teploty, tepové frekvence, pružnost cév, dechovou frekvenci, srdečních a plicních šelesty, vyšetření zraku, chuti, kašle, výtoku z nosu, sluchu a celkového chování zvířat. Pozornosti by neunikla ani přílišná aktivita nebo malátnost, stejně jako poruchy chůze, postavení končetin, stav paznehtů a výkalů.  Zjistilo se že vše je jak má být a že zvířata netrpí ani průjmem a ani zácpou.
Dalším objektem pozorování byl stav a vývoj pohlavních orgánů. Také zde nebyly zaznamenány nějaké změny k horšímu. Klinická vyšetření neminula ani vyšetření nervového systému, mentálních schopností, schopnost vnímat světelné podněty, zvuk , funkčnost receptorů pro teplo a tlak na končetinách i trupu. V pořádku se ukázaly být i motorické fukce končetin, páteře, svalový tonus, postoj a držení těla. Pozornosti neušlo ani ovládání obličejových nervů a zjišťování případných poruch spojených s projevy narušené inervace různých oblastí. Žádný náznak poruchy nebyl zjištěn. Je to tak trochu k nevíře. Zvířeti „vyšmykneme“ z jeho genomu protein, který má v mozku a dalších tělních buňkách a ono se to na něm nijak neprojevuje. Zvířata bez prionového proteinu se v žádném ze sledovaných parametrů nelišila od zdravých zvířat v kontrole.

Zvětšit obrázek

Prvním výsledkem projektu, který směřuje k tvorbě skotu bez prionového proteinu – zcela zdravý býček. (Foto: Hematech, Inc.)

Už se jednu chvíli zdálo, že vědci přece jen na něco narazili. Jeden parametr krve nebyl vpořádku. Vzorky krve byly odebrány pěti pokusným zvířatům a byly porovnávány s krevními vzorky od pěti stejně starých zvířat v kontrole. Telata bez prionů sice měla mírně nižší hodnoty vyjadřující množství erytrocytů vkrvi (nižší sediment). Ale bližší kontrola stavu funkčnosti erytrocytů nevykázala nějaký rozdíl ve schopnostech erytrocytů vázat a uvolňovat  plyny. Celková analýza krevních vzorků neprokázala nějaké významné rozdíly a všechny parametry, včetně menšího obsahu erytrocytů v krvi, nevybočily z uznávané obecné normy. Tedy zase nic.

Histopatologové
Přirozený prionový protein je nejvíce vyjádřen v nervových buňkách a v bílých krvinkách, lymfocytech. Jak jsme si řekli, jeho množení a akumulace v mozku vede k jeho degeneraci a ke vzniku prionových chorob. Dopad likvidace genu pro tento protein s následnou jeho absencí v mozku zkoumali histopatologové. Stav mozku vyšetřili u dvou kusů skotu, které kvůli tomu museli utratit (aby mohli získat vzorky a provést řezy na mozkové tkáni k jejímu mikroskopickému rozboru). Jako kontrola sloužili dva normální býčci ve shodném věku 14 měsíců. Žádné léze, ani další změny v poměrech vnitřního uspořádání nezjistili. Hodnoceno bylo čtrnáct parametrů pokrývajících záležitosti šedé kůry mozkové, mozečku, hipokampu,... Kromě toho byla podrobena zkoumání i mícha v oblasti krku,hrudníku a beder. Řezy nervovétkáně byly zkoumány světelným mikroskopem. Vzorky neodhalily nějaké rozdíly.

Zvětšit obrázek

Korejský klon skotu odolného proti BSE z roku 2004

U prionových chorob hraje významnou úlohu imunitní systém. Sledování zdravotního stavu se zaměřilo i na tuto oblast. Zjištění počtů dvou hlavních populací lymfocytů (T a B buňky) neukázal žádný rozdíl mezi zdravými zvířaty a zvířaty bez prionového proteinu.
Nyní poněkud odbočíme od skotu kmyším, protože již dříve byly publikovány práce o tom, že myši, jimž byl knokautován gen pro prionový protein (obdoba stávajícího pokusu u skotu), ukazovaly na to, že lymfocyty takto postižených zvířat mají sníženou reakci na dráždění mitogeny. Mělo se tedy za to, že prionový protein hraje v těle úlohu na níž závisí správná funkce imunitního systému – schopnost reagovat na podněty a včasným zahájením patřičné odpovědi po napadení bakteriální či virovou infekcí. U skotu se ale tento neblahý vliv, vyřazení genu pro prionovy protein na snížené funkčnosti imunitního aparátu, neprojevil. To znamená, že domněnka o jeho úloze v lymfotech při rozpoznávání cizího a vlastního a jeho účast ve správném fungování imunitního aparátu, se neukázala být správnou. Funkce tohoto proteinu v našich tělech zůstává dál neobjasněna.

Rozdílné výsledky ohledně dopadu knokautovánígenu pro prionový protein u myší a u skotu nedaly výzkumníkům spát. Naplánovali tedy ještě jeden test, který měl do situace vnést jasno. Tentokrát se nejednalo o test na zvířecích buňkách ve zkumavce, ale o prověření funkčnosti systému na živém zvířeti. Vědci telatům injekčně vpravili látky (mitogeny konkanavalin a phytohemagglutinin). Jsou to látky, které imunitní systém považuje za nebezpečné vetřelce a reaguje na ně masívním množením obranných buněk – lymfocytů řady T. Ukázalo se, že jak zvířata v pokusu, tak ta z kontrolní skupiny, reagovala na tyto podněty shodně. Ani tvorba interferonu nebyla u zvířat v pokusu nikterak dotčena. Také další test, který spočíval na imunizaci proteinem z vaječného bílku (ovalbumin), ten zase navozuje masívní tvorbu protilátek uvolňovaných do krve. Ani to ale neukázalo na nic, co by naznačovalo, že imunitní systém je chybějícím prionovým proteinem nějak dotčen.

Zvětšit obrázek

Jde o geneticky modifikovaná zvířata (klony), která nemohou onemocnět BSE. (Foto Hematech, Inc.)

Pohlavní dospělost nastala u býčků v patřičné době (16 měsíců) a odebrané semeno také nevykazovalo změny. Spermie byly schopny oplození a vzniklé zárodky se zdárně vyvíjely v blastocysty. Dvanáct blastocyst získaných oplodněnímin vitro bylo implantováno do osmi krav a ty zůstaly březí. To svědčí o tom, že zvířata s knokautovaným genem pro prionový protein jsou schopna dát vznik potomstvu. Plodnost býků se jeví být zcela normální.

Podle nás zbytečným testem, který vědci prováděli, byla zkouška, zda fašírka z mozků bezprionových zvířat bude mít schopnost zmnožit zašmodrchané priony, neboli rozmnožit infekční částice. Výsledek se dal očekávat. V homogenátu tkáně mozků se nic nedělo. Jak by ostatně mohlo, když topodstatné - substrát ze kterého priony vznikají, chyběl.  U kontrolních, normálních, odporažených býčků byla situace jiná. Dodané priony se v homogenátu jejich mozků vesele množily.

Kromě zvířat utracených za účelem pokusů s jejich mozkovou tkání se dalších devět zvířat, bez jakýchkoliv klinicky pozorovaných změn, dočkalo dospělosti a věku 20 měsíců.  Vše tedy nasvědčuje tomu, že zvířata se bez zmíněného proteinu obejdou. A že jeho chybění u nich nevede k nepříznivým následkům. Jedinékčemu u nichdojde je, že se tato zvířata stávají odolnými proti prionovým chorobám. Množné číslo jsem zde uvedl proto, protože je zde na místě. Vědci totiž neprovedli na homogenátech z mozků pokus jen na množení BSE prionu, ale též pokus na množení prionů izolovaných z nemocných norků. Tyto norčí priony jsou pro skot skot stejně smrtelné, jako priony BSE. Ukázalo se tedy, že skot se zřejmě tímto zásahem stal odolným vůči všem prionovým chorobám.

Myši ale mají problémy
Některé pokusy na knokautovaných myších naznačovaly, že zvířata bez prionového proteinu mají narušený cirkadiální rytmus spánku a bdění. Nebo mají snížené funkce spojené s přenosem vzruchu přes synaptické nervové spoje. Jiné pokusy na myších to ale zase nepotvrdily. Stejně tak sledování spánkového režimu knokautovaných telat po dobu jednoho týdne, který zahrnoval sledování aktivit během dne i v noci, neukázal na nějaké rozdíly, ve vztahu k normálním zvířatům.

Závěr
Zmíněný knokautovaný skot se zdá být vhodným zvířetem, které by mělo být preferováno pro výrobu produktů.  Například těch, se kterými se uvažuje při přípravě biotechnologických produktů pro zdravotnictví. Příkladem jsou protilátky a hormony vyráběné krávami za účelem léčby lidí. Skot používaný k výrobě želatiny, kolagenu, séra a plasmy.

Než jsme se seznámili s podrobnostmi, tak nám to připadalo jen jako „pokus pro pokusy“.  Nyní si naopak myslíme, že největší význam tohoto pokusu je v tom, že metodu lze uplatnit v praxi. Jde o to, že tato technika jeví být bezpečnou - nevede ke zhoršení zdravotního stavu jedince.  To znamená, že se tu otevírá dlouho očekávaná cesta budoucích úprav genomu i na jiných místech. A nemusí přitom jít jen o „ničení genů“. A dokonce nemusí jít už jen jen o skot.  

Mohlo by se ztát, že s tím jak vstoupil v platnost zákaz krmit skot masokostní moučkou, hrozba prionové choroby klesá. Není tomu tak docela. Nové poznatky totiž ukazují na fakt, že tak jako u lidí, tak i u skotu existuje více forem spongiformních encefalopatií. Skot může mít BSE i bez toho, aniž  by  do styku s živočišnými produkty přišel. Chov tohoto skotu by byl cestou, jak zabránit případnému přenosu infekčních prionů na člověka.    
Na těchto zvířatech se zřejmě podařilo demonstrovat předznamenání cesty, jakou se živočišné biotechnologie budou ubírat dál v 21. století.

Pramen: ARS, Nature, informace poskytnuté Juergenem Richtem a Kari Watsonovou, z MacDougall Biomedical Communications, Inc.