Princíp nanopórového sekvenovania spočíva v meraní zmeny elektrického prúdu počas prechodu reťazca nukleovej kyseliny nanopórom polymérovej membrány. Kredit: DataBase Center for Life Science , CC BY 4.0

Keď boli objavené antibiotiká, boli to zázračné lieky. Milióny ľudí sa uzdravovali z infekčných chorôb, ktoré boli dovtedy smrteľné a štatistiky príčin úmrtí sa prepisovali od základu – infekcie z ich čela postupne zmizli. Ale antibiotiká sa uplatnili nielen v humánnej, ale aj veterinárnej medicíne, kde sa začali široko a často neidikovane používať. Následkom bolo rozšírenie kmeňov baktérii, ktoré neboli na antibiotiká vnímavé a vznik problému antibiotickej rezistencie, ktorý trvá dodnes. Okrem toho, v niektorých vyspelých, ale aj rozvojových krajinách sa antibiotiká aj dnes používajú skutočne bezhlavo, bez ohľadu na šírenie rezistentných kmeňov. Čo je horšie, ľahkovážne sú používané nielen základné antibiotiká, ale aj rezervné, ktoré sú v krajinách so zodpovedným systémom antibiotickej politiky určené len na liečbu závažných ochorení, spôsobených kmeňmi baktérii, rezistentnými na bežné antibiotiká. Roky publikované varovania, že pri dnešnom spôsobe zaobchádzania s antibiotikami nakoniec prevládnu rezistentné kmene baktérii, na ktoré bude dostupná antibiotická liečba neúčinná, sa síce nenapĺňajú, ale rezistentných kmeňov, nosokomiálnych baktérii, vzdorujúcich nielen antibiotikám, ale aj bežným dezinfekčným prostriedkom je dosť na to, aby spôsobovali smrť mnohým ťažko chorým pacientom. Následkom antibiotickej rezistencie, alebo v súvislosti s ňou ročne umierajú milióny pacientov.

Bežné mikrobiologické vyšetrenie sa vykonáva kultiváciou baktérii na vhodnom substráte. Kredit: masakazu sasaki.

Pravidlá, ako brániť rozvoju rezistencie na antibiotiká sa v princípe nemenia. Stále sa zdôrazňuje potreba užívať antibiotiká uvážene, voliť ich podľa predpokladaného patogénu a na základe monitorovania rezistencie, ale v praxi tieto odporúčania niekedy ťažko dodržať. Sú situácie, kde sa s nasadením antibiotickej liečby nedá otáľať a jej odklad ohrozuje život pacienta, napríklad pri sepse ("otrave krvi") alebo meningokokovej meningitíde sa musí o nasadení antibiotickej liečby rozhodnúť v priebehu niekoľkých hodín. Aby liečba zasiahla presne neurčeného pôvodcu infekcie, kombinuje sa hneď niekoľko širokospektrálnych antibiotík a počíta sa aj s tým, že niektoré budú neúčinné. To je presne to, čo všeobecné pravidlá antibiotickej liečby neschvaľujú - podporí sa tým selekcia a prerastanie rezistentných kmeňov, ktoré sa dokážu množiť a pretrvávať v nemocničnom prostredí.

C-reaktívny proteín (CRP) je predmetom vyšetrovania sére. Je to jedna z reakčných látok akútnej fázy zápalu. Svoje meno dostal preto, že sa vysráža s pneumokokovým C-polysacharidom. Kredit: Jawahar Swaminathan,  European Bioinformatics Institute.

Žiadalo by sa rýchle vyšetrenie pôvodcu infekcie a jeho citlivosti na antibiotiká. Ale v súčasnosti trvá určenie pôvodcu infekcie a jeho citlivosti na antibiotikum pomocou kultivácie biologického materiálu trvá najmenej 3 dni. Toto oneskorenie môže byť pre vážne chorých pacientov osudné. Okrem toho, necielené podávanie antibiotík prispieva k selekcii rezistentných kmeňov baktérii. Dosť veľkým pokrokom bolo zavedenie vyšetrenia C-reaktívneho proteínu (CRP) do bežnej praxe lekárov prvého kontaktu. Toto vyšetrenie vo väčšine, hoci zďaleka nie vo všetkých prípadoch, dokáže odlíšiť infekciu, vyvolanú baktériami od infekcie vírusmi, kde je podanie antibiotík ako prvej liečby zbytočné.

Pre niektoré mikroorganizmy sú dostupné PCR testy, ktorých výsledky sú k dispozícii v priebehu málo hodín, napríklad je možné potvrdiť pôvodcu vyššie zmienenej, potenciálne smrtiacej bakteriálnej meningitídy, ale citlivosť na antibiotiká sa nimi nedá stanoviť. Výskumníci z francúzskeho France’s National Institute for Research in Digital Science and Technology (Inria) pracujú na metóde, ktorá môže poskytnúť potrebné informácie v priebehu niekoľkých hodín.

Laboratórne zariadenia na sekvenovanie. Nanopóry prepúšťajú iba jednovláknovú DNA v lineárnej sekvencii. Táto metóda umožňuje analýzu v reálnom čase a sekvenovanie nukleotidov od krátkych po ultra dlhé sekvencie. Kredit: Oxford Nanopore Technologies (ONT).

Nový prístup sa zakladá na tom, že rezistencia na antibiotiká vzniká mutáciou v bakteriálnom genóme a dá sa odhaliť sekvenovaním, ktorého konvenčné metódy sú ale časovo náročné. Karel Břinda, PhD. z tímu GenScale v Inria Rennes, ktorý sa špecializuje sa na výpočtovú genomiku a rýchle diagnostické metódy, však vyvinul techniku, ktorá je založená na porovnávaní bakteriálnej DNA zo vzoriek materiálu od pacientov s referenčnou databázou genómov baktérií so známou citlivosťou na antibiotiká. Je predpoklad, že baktérie s podobnými sekvenciami DNA majú pravdepodobne podobné profily antibiotickej rezistencie. Metóda, nazvaná Genomic Neighbor Typing, vychádza z dát, získaných bežne dostupným kompaktným zariadením metódou nanopórového sekvenovania, ktoré je veľmi pohotové a poskytuje kontinuálny dátový tok. Čo je dôležité pre jej rýchlosť, zaobíde sa bez podrobného sekvenovania celého genómu. Nanopórové sekvenovanie už bolo použité počas sledovania šírenia vírusu Ebola v Afrike a teraz aj pre sledovanie výskytu variánt vírusu SARS-CoV-2. Predikcie citlivosti a rezistencie na antibiotiká síce môžu byť k dispozícii z iniciálnych dát už o 10 minút, ale v súčasnosti trvá príprava vzoriek niekoľko hodín.

Genomic Neighbor Typing je založené na osvedčenej a dostupnej technológii, ale k plnému zavedeniu do klinickej praxe bude potrebné vybudovanie veľkých a skutočne reprezentatívnych databáz bakteriálnych kmeňov, vrátane údajov o ich antibiotickej rezistencii aj s príslušnými softvérovými nástrojmi pre ich správu. Keď bola metóda prvý raz publikovaná, bola aplikovaná len na dva druhy baktérii (Streptococcus pneumoniae a Neisseria gonorrhoeae). Pre detekciu ďalších druhov bude potrebné metódu upraviť a získať reprezentatívne databázy genómov a ich metaúdaje, súvisiace s rezistenciou. Preto tím GenScale nadviazal spoluprácu s poprednou francúzskou výskumnou skupinou v oblasti rezistencie voči antibiotikám z Univerzitnej nemocnice Rennes, ktorá sa špecializuje na enterokoky. Potrebná však bude spolupráca s odborníkmi na ďalšie, najmä problematické druhy baktérii, ktorí disponujú znalosťami klinických aspektov a mechanizmov ich antibiotickej rezistencie.

Voľba antibiotík na základe známej citlivosti patogénov hneď od začiatku liečby by nielen pomohla pacientom, ale obmedzením zbytočnej a nesprávne cielenej aplikácie antibiotík by pomohla znížiť selekčný tlak na vznik nových rezistentných kmeňov baktérii.

Literatura

Serge Cannasse: 10-Minute Test Exposes Antibiotic Resistance Threat (Medscape)

Speeding up the diagnosis of antibiotic resistance (Inria Genscale Team)

Video: Nanopore Sequencing